Biologické čištění odstraňuje rozpustné organické látky, nutrienty jako dusík a fosfor, a většinu nerozpuštěných pevných látek, které nebyly odstraněny při mechanickém čištění. Uskutečňuje se působením mikroorganismů (aktivovaný kal) a je výsledkem jejich metabolické činnosti. Postupy biologického čištění odpadních vod dělíme obecně na technologie s biologickou kulturou přisedlou na pevném povrchu (biologické filtry) a na technologie s biologickou kulturou ve vznosu (aktivační nádrže). Aktivace (aktivační proces) v podstatě znamená kontinuální kultivaci mikroorganismů (aktivovaného kalu), které jsou již přítomné v odpadní vodě a ve vratném aktivovaném kalu. Vločky aktivovaného kalu obsahují organismy, které odstraňují znečištění působením aerobního/oxického, anoxického a anaerobního prostředí. Jakmile jsou znečišťující látky odstraněny, aktivovaný kal ve formě vloček se separuje od vody v dosazovací nádrži gravitací. Část kalu (vratný aktivovaný kal) na dně dosazovací nádrže potom recirkuluje zpět, aby se smísil s mechanicky předčištěnou vodou. Zbytek kalu (přebytečný aktivovaný kal) se odstraní, aby se neporušila ideální rovnováha mikroorganismů. Biofiltry – nádrže vyplněné médiem využívají, že se mikroorganismy přichytnou na médiu a vytvoří biologický film. Odpadní voda se po mechanickém předčištění nastříkává na médium pokryté biofilmem, v kterém mikroorganismy odstraňují znečišťující látky. Stejně jako u aktivace se voda s fragmenty biofilmu a vloček z biologického filtru odvádí do dosazovací nádrže k separaci, kde se kal recykluje a likviduje, a čistá voda se vypouští do dalšího procesu.
Pro efektivní fungování biologického čištění vyžadují organismy nutrienty ve vyváženém poměru, včetně uhlíku, dusíku a fosforu (poměr C:N:P), dále stopové prvky včetně železa, mědi, zinku, niklu, manganu, draslíku, síry a dalších složek, které jsou typicky přítomné v odpadní vodě. Obecně používaný poměr C:N:P je 100:5:1, ačkoli některé ČOV fungují optimálně v jiném poměru, zatímco jiné se potýkají s tvorbou polysacharidového slizu nebo nárůstem vláknitých bakterií, které inhibují biologii a usazují se v dosazovací nádrži.
K dokončení biologického čištění lze použít více způsobů: aktivaci s cirkulací, směšovací aktivaci, sekvenční dávkové reaktory (SBR), oxidační příkopy, biofiltry, bioreaktory s pohyblivým ložem, spojení biofilmu se suspendovaným aktivovaným kalem (IFAS) a další.
Biologické odstraňování nutrientů využívá změny prostředí mikroorganismů tak, aby se z vody odstranil dusík a fosfor. Tyto biologické pochody se dělí na zónu anaerobní (bez kyslíku a dusičnanů), anoxickou (bez kyslíku, dusičnany jsou přítomné) a aerobní/oxickou (kyslík je přítomen), kdy voda „putuje“ kvůli jejímu biologickému vyčištění jednotlivými zónami.
Lze také použít chemické postupy, jako například chemické odstraňování fosforu, kdy se dávkuje srážedlo do aktivace nebo do odtoku z aktivace před dosazovací nádrž. Nerozpustné sloučeniny vzniklé srážením se pak separují společně s kalem.